免疫熒光（IF）方案
原理
免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測定含量。
免疫熒光技術(shù)有兩個主要步驟：首先，在抗體的作用下，將抗體與抗原結(jié)合；其次，將熒光染料通過實時抗體分子結(jié)合抗原，使抗原表位處發(fā)出熒光信號，以此來檢測抗原的存在與否。
利用免疫熒光技術(shù)的主要優(yōu)勢在于可以用來檢測幾乎所有的抗原表位，提供一種高精度的檢測方法，可以在原來檢測抗體特異性的抗原表位上提升靈敏度。此外，免疫熒光技術(shù)還可以用來檢測細(xì)胞內(nèi)特異性抗原，可以提供細(xì)胞內(nèi)特征信息，對細(xì)胞功能和表型的研究有重要的意義。
用途
檢測細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原的定位或相對表達(dá)。
步驟
1. 樣品準(zhǔn)備
● 細(xì)胞樣品的制備
熒光顯微鏡用于檢測熒光信號。為了與該設(shè)備兼容，細(xì)胞需要在特定的材料上培養(yǎng)。典型的包括玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿和玻璃蓋片。細(xì)胞密度不宜過大。
● 組織樣本的準(zhǔn)備
石蠟切片需要脫蠟、水化和抗原修復(fù)步驟(參考免疫組化方案),然后與抗體 孵育進(jìn)行熒光檢測。
冷凍切片應(yīng)先在室溫平衡10-20min。 然后，切片用4%甲醛固定10-15min。 用0.2% TritonX-100 滲透20min, 并對細(xì)胞樣品進(jìn)行滲透。
2. 固定和滲透作用
樣品的固定和滲透是決定實驗成功的關(guān)鍵步驟。醛基固定劑(如甲醛、福爾馬林和戊二醛)和脫水固定劑(如乙醇)常被用作固定劑。基于醛的固定劑穿過細(xì) 胞膜，也可以與細(xì)胞蛋白質(zhì)交聯(lián)，穩(wěn)定和硬化樣品。與脫水固化劑相比，醛基固化劑效果更好。所以我們建議用4%的甲醛固定細(xì)胞。為了使抗體接觸到目標(biāo)蛋白，需要進(jìn)行滲透作用。洗滌劑常被用作滲透試劑。推薦使用TritonX- 100。它能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上形成許多小孔。這些小孔為抗體提供了一個通道，使其能夠接觸到目標(biāo)蛋白質(zhì)。與醇類相比，醛類能更好地穿過質(zhì)膜并固定可溶性蛋白，但某些靶標(biāo)在醛類交聯(lián)時會失去抗原性。
(1) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。
(2) 用4%甲醛固定細(xì)胞10-15min
(3) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。
(4) 用1% Triton X-100于室溫滲透細(xì)胞20分鐘。
(5) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。
3. 封閉
這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質(zhì)之間的非特異性結(jié)合。我 們常用的阻斷液是正常的山羊血清(品種必須與二抗一致)。血清不僅能阻斷非特異性結(jié)合蛋白，還能阻斷細(xì)胞或組織中的FC受體。
(1) 用10%正常山羊血清于室溫阻斷1h。
(2) 擦去多余的液體，保持樣品濕潤。
4. 抗體孵育
(1) 按照推薦的稀釋比例制備一抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液中。
(2) 一抗4℃孵育過夜。
(3) 用PBS沖洗細(xì)胞三次。
(4) 按照推薦稀釋比例在暗處制備二抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液。
(5) 二抗室溫孵育1h。
(6) 用PBS沖洗細(xì)胞三次。
5. 核染色
DAPI常被用作核試劑，以使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。按說明書稀釋DAPI試劑，與樣品孵育適當(dāng)時間。染色時間不宜過長。
6. 檢測
將樣品置于黑暗中，盡快用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描檢測熒光信號。
常見問題
1. 整個細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光亮點?
(1) 二抗?jié)舛冗^高，適當(dāng)降低二抗?jié)舛燃纯伞?/p>
(2) 二抗發(fā)生沉淀，可以使用過濾或者離心熒光標(biāo)記二抗。
2. 信號弱或無信號，染色細(xì)胞過少?
(1) 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達(dá)；制備細(xì)胞裂解液，用 Westerm Bloting 驗證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)；
(2) 表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少：標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞，試用其他瞬時轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
(3) 細(xì)胞通透性差：增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透；
(4) 染色前的固定步驟破壞了抗原表位：改用其他固定方法；
(5) 通透處理使抗原丟失：減少通透劑作用的時間或強度；
(6) 抗體不識別：換用其他抗體；
(7) 一抗稀釋度過大：同一樣品按最佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定 更佳的一抗稀釋比例；
(8) 二抗選擇錯誤：使用正確的二抗。
3. 只有 DAPI 的藍(lán)光，目的熒光幾乎沒有或者很弱。
出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發(fā)熒光強度不夠大；二抗是否是對應(yīng)的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結(jié)果加為山羊抗免。
4. 細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍(lán)色的小點點。
此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2 周后再檢測，或者通 過提高共聚焦背景值來覆蓋支原體熒光。
5. 共定位的視野該如何選擇?
共定位時，首先判斷哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染成功的，比如我過表達(dá)了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guān)系，則在視野中尋找已成功轉(zhuǎn)染蛋白A的細(xì)胞，一般熒光強度會顯著高于周邊其他細(xì)胞，再在這個細(xì)胞上觀察蛋白B的表達(dá)。
6. 視野中細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點。
有兩種情況可造成：
(1) 拍照時PBS量過少引起的非特異性；
(2) PBS未過濾，未溶解的殘渣黏附而導(dǎo)致。
