ELISA試劑盒操作流程及技術(shù)要點
酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
本講以雙抗體夾心法為例，詳細(xì)闡述ELISA的操作流程及技術(shù)要點，希望對科研朋友的實驗有所幫助。
1. 試劑配制
1.1 標(biāo)準(zhǔn)品
① 從試劑盒中取出一支標(biāo)準(zhǔn)品，于6000-10000rpm離心30秒。用1mL樣本稀釋液溶解，并用槍頭對準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5次以助溶解，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品S7，放置備用。
② 取7個1.5mL 離心管(S0-S6)依次排列，各加入250µL樣本稀釋液。吸取250µL 標(biāo)準(zhǔn)品S7到第一個離心管中(S6)，輕輕吹打混勻。從S6中吸取250µL到第二個EP管中(S5)，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為樣本稀釋液。
| 編號 | S7 | S6 | S5 | S4 | S3 | S2 | S1 | S0 |
| pg/mL | 2000 | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 0 |
1.2 洗液工作液
濃洗滌液按1:25倍用去離子水進(jìn)行稀釋。例如用量筒量取240mL去離子水，倒入燒杯或其他潔凈容器中，再量取10mL濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
1.3 生物素標(biāo)記抗體工作液
生物素標(biāo)記抗體液按1:100倍用生物素標(biāo)記抗體稀釋液進(jìn)行稀釋。如10μL生物素標(biāo)記抗體加990μL生物素標(biāo)記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內(nèi)配妥。
1.4 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素按1:100倍用辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液進(jìn)行稀釋。如10μL辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μL辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內(nèi)配妥。
2. 重要提示
2.1 實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭Ｔ噭┗驑颖鞠♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。
2.2 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便管蓋和管壁上的液體集中到管底。
2.3 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
2.4 因?qū)嶋H裝量多于標(biāo)示裝量，配制工作試劑請用精準(zhǔn)的計量工具（移液槍或量筒等）量取，切勿不經(jīng)量取直接使用。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.4mL。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
2.6 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋請勿于板中進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)于臨用前15分鐘內(nèi)配制。為保證實驗有效性，建議每次實驗使用新的標(biāo)準(zhǔn)品。若保存得當(dāng)，溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品S7可在2-8℃保存，7天內(nèi)使用有效。
3. 操作步驟
3.1 將各種試劑移至室溫（18-25℃）平衡至少30分鐘，按前述方法配制試劑，備用。
3.2 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2小時
3.3 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.4 每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時。
3.5 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200μL/每孔，甩干。
3.6 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時。
3.7 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200μL/每孔，甩干。
3.8 依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色15-30分鐘。
3.9 依序每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)。
3.10 在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
4. 操作要點
4.1 為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本均設(shè)雙孔測定。每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.2 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先用樣本稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣本符合試劑盒的檢測范圍，最后計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
4.3 加樣：加樣時，請使用一次性的潔凈吸頭，避免交叉污染。加樣時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡，將樣本加于酶標(biāo)板孔底部，切勿沿孔壁加樣。一次加樣時間最好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4.4 溫育：為防止樣本蒸發(fā)或污染，溫育過程中酶標(biāo)板必須覆上板貼，實驗過程中酶標(biāo)板應(yīng)避免處于干燥的狀態(tài)。溫育過程中應(yīng)隨時觀察溫箱溫度是否恒定于37℃，及時調(diào)整。溫育過程中，溫箱不易開啟太多次，以免影響溫度平衡。
4.5 洗滌：洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
● 手工洗板方法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液按200μL/孔注入孔內(nèi)，浸泡2分鐘。根據(jù)操作步驟中所述，重復(fù)此過程數(shù)次。
● 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
4.6 顯色：為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。可在加入底物溶液后每隔一段時間觀察一下顯色情況以控制反應(yīng)時間（比如每隔10分鐘）。當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品前3-4孔有明顯梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。
4.7 底物溶液應(yīng)為淺藍(lán)色或無色，如果顏色嚴(yán)重變深則必須棄用。底物溶液易受污染，請避光妥善保存。
