無細(xì)胞蛋白表達(dá)與純化服務(wù)
無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)又稱為體外翻譯系統(tǒng)。無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系是以外源目的mRNA或DNA為模板，在細(xì)胞抽提物的酶系中通過人工添加蛋白質(zhì)合成所需的底物和能量，合成目的蛋白質(zhì)的體外蛋白合成系統(tǒng)。無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)模擬生物細(xì)胞的生命現(xiàn)象，重現(xiàn)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯過程，它需要包含蛋白質(zhì)合成過程中所必需的各種原料、能量、轉(zhuǎn)錄因子和翻譯因子等。
該系統(tǒng)尤其適于膜蛋白和毒性蛋白的表達(dá)，同時(shí)具有周期短、通量高的特點(diǎn)。
該系統(tǒng)已有10多年歷史，但是技術(shù)難度較大。目前全球范圍內(nèi)，無細(xì)胞表達(dá)主要以Rothe、Promega等公司提供的試劑盒表達(dá)方案為主，條件單一，價(jià)格昂貴。華美生物是國(guó)內(nèi)第一批掌握大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)體系全套核心技術(shù)的公司，所有試劑均自配，核心組分均自產(chǎn)，反應(yīng)體系含40余種成分，均可自由調(diào)整優(yōu)化。自2015年建立該平臺(tái)以來，已成功制備400多種蛋白，其中包含300多種傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)難以表達(dá)的1-15次跨膜蛋白和毒性蛋白，其中含有分子量高達(dá)130kDa-140kDa的多次跨膜蛋白。
系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)
- 不受細(xì)胞結(jié)構(gòu)限制，可以表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞有毒的外源蛋白質(zhì)；
- 高通量，可以在多孔板上在各種不同條件下同時(shí)表達(dá)幾種不同的蛋白，適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究；
- 開放式反應(yīng)系統(tǒng)使反應(yīng)條件易于更改，有助于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和后翻譯修飾；
- 允許添加非天然氨基酸或同位素標(biāo)記的氨基酸來合成特殊用途的蛋白質(zhì)；
- 步驟少，實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備依賴性較低。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)
- 超高性價(jià)比，低至5500元起；
- 貨期短，20-25個(gè)工作日內(nèi)即可交付；
- 產(chǎn)量高，部分蛋白可以達(dá)到5mg/mL。
我們承諾
注：該無風(fēng)險(xiǎn)定制蛋白服務(wù)僅適用于800個(gè)氨基酸以內(nèi)的蛋白質(zhì)。如果您需要表達(dá)超過800個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，我們將按步驟收費(fèi)。
特色技術(shù)平臺(tái)
去污劑是同時(shí)具有親水極性基團(tuán)和疏水非極性基團(tuán)的雙極性分子，能夠使脂膜解體釋放膜蛋白，并在溶液中為去膜狀態(tài)下的膜蛋白提供疏水環(huán)境，維持膜蛋白的疏水跨膜結(jié)構(gòu)。
華美生物搭建了基于無細(xì)胞表達(dá)的去垢劑技術(shù)平臺(tái)。通過體外添加DNA模板、ATP、氨基酸、各種底物、細(xì)胞抽提物的酶等合成蛋白質(zhì)，篩選不同去垢劑來提取目的蛋白，可很好溶解純化跨膜蛋白，幫助其在溶液中形成天然正確構(gòu)象。
在含有去垢劑的緩沖液中，大部分膜蛋白可以維持穩(wěn)定性和活性。但少數(shù)對(duì)去垢劑敏感的膜蛋白是不適宜含有去垢劑的緩沖條件的，具體表現(xiàn)為無法純化，穩(wěn)定性不好和沒有活性。
華美生物搭建了基于無細(xì)胞表達(dá)的Nanodisc技術(shù)平臺(tái)。通過體外添加MSP，磷脂分子使其在反應(yīng)過程中邊表達(dá)邊組裝成Nanodisc結(jié)構(gòu)，保持其生物學(xué)活性并有很好的水溶性。
服務(wù)內(nèi)容
| 步驟 | 服務(wù)項(xiàng)目 | 服務(wù)說明 | 華美生物特色 | 周期 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 質(zhì)粒構(gòu)建及制備
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密碼子優(yōu)化、全基因合成 | 多載體優(yōu)化 為了得到最高的表達(dá)量并且最低的序列修飾，除常規(guī)N端融合表達(dá)蛋白外，我們還提供N端短肽優(yōu)化表達(dá)服務(wù)。N端短肽包含6-11個(gè)氨基酸，可提高mRNA翻譯效率，從而提高蛋白產(chǎn)量。 |
6-9工作日 | |
| PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過酶切連接到pET系列載體上 | |||||
| 重組質(zhì)粒大量制備 | |||||
| 2 | 小試表達(dá)及優(yōu)化
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多載體多反應(yīng)條件優(yōu)化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，以確定最優(yōu)反應(yīng)條件 | 多條件表達(dá)方案 無細(xì)胞表達(dá)能在多孔板上按照多種不同的條件，多種不同的蛋白同時(shí)平行進(jìn)行。我們提供多條件優(yōu)化表達(dá)服務(wù)。 |
5-7工作日 | |
| 3 | 目標(biāo)蛋白表達(dá)及純化
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根據(jù)小量結(jié)果提供1-10ml放大體系表達(dá) | 6-9工作日 | ||
| 通過親和、離子交換及分子篩等多種層析方法純化目的蛋白 | 多條件純化方案（可選） 針對(duì)膜蛋白，我們提供不同去垢劑純化服務(wù)，以確保您的膜蛋白適合的最佳緩沖。活性膜蛋白最適合采用該優(yōu)化方案。 |
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| 4 | 其他（可選）服務(wù)
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收費(fèi) | 酶切去標(biāo)簽服務(wù) | 靈活的附加服務(wù)（可選） 提供多種附加服務(wù)，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活選擇 |
3個(gè)工作日 |
| 免費(fèi) | 可提供無菌操作、內(nèi)毒素去除和凍干等服務(wù)（備注：凍干與無菌操作不可同時(shí)滿足） | 2個(gè)工作日 | |||
| 5 | 質(zhì)控
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進(jìn)行純度、濃度等檢查，并提供QC報(bào)告 | 詳細(xì)的質(zhì)控報(bào)告 為每個(gè)項(xiàng)目提供產(chǎn)品說明書及完善的質(zhì)控報(bào)告 |
3-5工作日 | |
| 總時(shí)間 | 20-30工作日 | ||||
案例展示
案例1：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)多次跨膜蛋白
以下三個(gè)蛋白質(zhì)分別具有5、6和7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。由于在體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)中難以表達(dá)多次跨膜蛋白質(zhì)，或者產(chǎn)量非常低，華美生物使用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來制備這三個(gè)蛋白質(zhì)。為了增加產(chǎn)量，我們嘗試了各種表達(dá)條件供客戶選擇。圖1、2和3分別展示了這三個(gè)蛋白質(zhì)在不同條件下的小規(guī)模表達(dá)情況，并選擇最佳條件進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)。
Lane1:反應(yīng)條件1
Lane2: 反應(yīng)條件2
Lane3: 反應(yīng)條件3
Lane4: 反應(yīng)條件4
Lane5: 反應(yīng)條件5
Lane6: 反應(yīng)條件6
Lane1:反應(yīng)條件1
Lane2: 反應(yīng)條件2
Lane3: 反應(yīng)條件3
Lane4: 反應(yīng)條件4
Lane5: 反應(yīng)條件5
Lane6: 反應(yīng)條件6
Lane1:反應(yīng)條件1
Lane2: 反應(yīng)條件2
Lane3: 反應(yīng)條件3
Lane4: 反應(yīng)條件4
Lane5: 反應(yīng)條件5
Lane6: 反應(yīng)條件6
案例2：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大分子量高次跨膜蛋白
所展示案例為9次跨膜蛋白，分子量為141.7kDa。基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)難以表達(dá)高次且大分子量跨膜蛋白。華美生物采用大腸無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)肉眼可見。
Lane1:反應(yīng)條件1
Lane2: 反應(yīng)條件2
Lane3: 反應(yīng)條件3
Lane4: 反應(yīng)條件4
Lane5: 反應(yīng)條件5
案例3：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)顯著提高蛋白表達(dá)量
這個(gè)項(xiàng)目的蛋白質(zhì)產(chǎn)量很低，華美生物采用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，通過優(yōu)化不同的N-末端肽，產(chǎn)量顯著提高，如圖5所示。
Lane 1: 標(biāo)簽 1
Lane 2: pET-28a(+) control
Lane 3: 標(biāo)簽2
Lane 4: 標(biāo)簽3
Lane 5: 標(biāo)簽4
Lane 6: 標(biāo)簽5
Lane 7: 標(biāo)簽6
Lane 8: 標(biāo)簽7
案例4：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)高活性膜蛋白
HTR1B為GPCR系列的膜蛋白，含有7次跨膜域。我們成功表達(dá)了該蛋白質(zhì)并進(jìn)行了功能活性驗(yàn)證，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。
The Binding Activity of HTR1B (7TM) with GSTK1
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized HTR1B at 5 μg/ml can bind human GSTK1, the EC50 of human GSTK1 protein is 159.40-218.50 ng/ml.
SLC7A11含有12次跨膜域。我們成功表達(dá)了該蛋白質(zhì)并進(jìn)行了功能活性驗(yàn)證，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。
The Binding Activity of SLC7A11 with anti-SLC7A11 recombinant antibody
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized human SLC7A11 at 2 μg/ml can bind anti-SLC7A11 recombinant antibody, the EC50 is 12.70-16.68ng/ml
案例5：無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使用不同去垢劑純化膜蛋白
圖1：FOS-12去垢劑純化7次跨膜蛋白
泳道1：蛋白1原樣
泳道2：穿透
泳道3-4：洗脫
泳道5：蛋白2原樣
泳道6：穿透
泳道7-8：洗脫
圖2：Brij-78去垢劑純化11次跨膜蛋白
泳道1-5：洗脫
泳道6：穿透
泳道7：原樣
聯(lián)系信息
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武漢華美生物工程有限公司成立于2007年12月，是一家集科研、生產(chǎn)、銷售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，遠(yuǎn)銷歐美日德等九十多個(gè)國(guó)家。
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