制備抗體時抗原的選擇

一天之計在于晨，一年之計在于春。那么制備一個抗體，抗原的設(shè)計和表達系統(tǒng)的選擇則至關(guān)重要，可以毫不夸張的說，設(shè)計出一個好的抗原對于制備一個高質(zhì)量抗體來說就是成功了一大半。

設(shè)計抗原時，對抗原的結(jié)構(gòu)分析、B細胞表位預(yù)測尤其重要。

1. 抗原的結(jié)構(gòu)分析

不同的蛋白類型，選擇的方法需要多樣性。大部分情況下，蛋白C端的親水性、表面可及性和柔性都相對N端較好。蛋白的二級結(jié)構(gòu)也是預(yù)測B細胞表位重要參數(shù)之一，β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位。含有5個以上的氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角又常稱為環(huán)(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop區(qū)可能為功能性抗體的識別位點，特異性好，可及性強。

Uniprot數(shù)據(jù)庫和CBS服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/)預(yù)測信號肽、跨膜、表位等結(jié)構(gòu)；EX-PASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/tools)上的GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法。親水性、柔韌性、表面可能性、抗原表位預(yù)測、α螺旋和β折疊可以應(yīng)用DNAstar軟件預(yù)測，同時可以結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)中的蛋白結(jié)構(gòu)分析。MOE軟件也可以預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)，同時MOE軟件可以從多個角度分析蛋白的結(jié)構(gòu)特性。

例如蛋白A：

1.1 信號肽分析時，表明該序列無信號肽

1.2 跨膜域分析，顯示該序列全部在胞外域

1.3 亞細胞定位預(yù)測

1.4 全長蛋白各功能域劃分

1.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)，親水性，抗原性，表面可極性，柔性分析

2. B細胞表位預(yù)測的方法及應(yīng)用

線性表位的預(yù)測方法： B細胞表位的預(yù)測方法主要集中于線性表位，大量的預(yù)測B細胞表位的算法都是基于蛋白質(zhì)序列。這些算法包括：蛋白質(zhì)的親水性算法、可及性算法、蛋白質(zhì)可塑性算法、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測算法、蛋白質(zhì)抗原性算法。這些方法的代表軟件有PEOPLE、PREDITOP、BEPITOPE、Bcepred、ABCpred、BepiPred、APP等。

構(gòu)象表位的預(yù)測方法：絕大多數(shù)B細胞表位預(yù)測方法都是基于蛋白質(zhì)的一級或二級結(jié)構(gòu)的，但這些方法只能用來預(yù)測由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位，而基于蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)來預(yù)測構(gòu)象表位的方法比較少，這是因為各種抗原的構(gòu)象表位可獲得的數(shù)據(jù)要遠遠少于線性表位。

基于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)來預(yù)測構(gòu)象表位的方法CEP：這是第一個以抗原蛋白的三級結(jié)構(gòu)PDB文件作為輸入條件，以構(gòu)象性表位預(yù)測為主要目的的網(wǎng)上免費服務(wù)軟件。由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種，因此，可以參這些方法來預(yù)測B細胞表位。

分子對接：主要用來研究分子間的相互作用與識別，進而預(yù)測復(fù)合物結(jié)構(gòu)。常用的分子對接軟件有ZDOCK、DOT、DOCK、ClusPro等。

3. 抗原的表達系統(tǒng)的選擇

通過對抗原的結(jié)構(gòu)和B細胞表位分析預(yù)測后，然后再結(jié)合抗體的使用要求，進行選擇適當(dāng)?shù)膮^(qū)間以及表達系統(tǒng)進行抗原表達純化。

針對于簡單的應(yīng)用WB\IHC\IF\IP這類的檢測應(yīng)用型的抗體，我們推薦的是蛋白的成熟的非跨膜區(qū)間，表達系統(tǒng)可以選擇大腸、酵母這種成功率高、經(jīng)濟成本相對于較低的蛋白表達系統(tǒng)，抗體的類型可以選擇多抗和單抗。同時，這類型的抗體還可以選擇直接合成多肽偶聯(lián)載體后作為抗原，進行免疫動物。

如果是正對與IF、FC、細胞、抗體結(jié)合等實驗的話，我們推薦的蛋白是全長的或者成熟的跨膜和非跨膜區(qū)間，表達系統(tǒng)主要選擇無細胞、哺乳、酵母這類具有蛋白活性或者能表達出全長的表達系統(tǒng)進行表達蛋白，對應(yīng)的抗體類型主要選擇單抗和基因工程抗體。

各種分析網(wǎng)站：

https://psort.hgc.jp/form2.html 亞細胞定位分析

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/ 信號肽分析

http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html 跨膜分析

https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html 線粒體轉(zhuǎn)運肽分析

http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi 核定位分析

http://www.proteinatlas.org/ 表達預(yù)測（人種屬）

https://bgee.org/?page=gene 表達豐度預(yù)測

http://old.protein.bio.unipd.it/espritz/ 結(jié)構(gòu)無序性分析

https://swissmodel.expasy.org/ 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 糖基化修飾預(yù)測分析