蛋白常見問題及解答
Q: 什么是蛋白表達和純化？
蛋白表達是一種生物技術過程，用于產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)。它可以在原核生物、真核生物或體外大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行。蛋白純化是一系列旨在從細胞或生物體中分離出一個或幾個蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)純化的最常用方法是親和層析，它通過不同的蛋白質(zhì)標簽進行設計。其他蛋白質(zhì)純化方法包括離子交換層析、分子排阻層析、拋光純化和疏水相互作用層析，可用于處理高純度的無標簽蛋白質(zhì)。
Q: 蛋白質(zhì)是如何純化的？純度是否有保證？
根據(jù)融合蛋白的標簽類型和蛋白質(zhì)本身的理化特性設計最佳純化方案。常用的純化方法包括：親和層析、疏水層析、離子交換層析、分子篩、鹽析等。我們保證的最低純度標準為〉85%。如果初始純化未達到此標準或客戶有更高的純度要求，我們還擁有AKATA純化儀器，該儀器高度自動化、精確控制，結(jié)合使用各種柱子，確保我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度進一步提高，并在COA報告上顯示最終純度測試結(jié)果。
雖然我們保證的最低純度標準為>85%，但我們制備的一些蛋白質(zhì)的純度達到了95%甚至97%。
Q: 為什么沒有或蛋白表達量很低？
可能存在的原因有：
a. 向量構(gòu)建錯誤。您應該通過測序確認向量或申請CUSABIO定制克隆服務。
b. 稀有密碼子。你應該優(yōu)化密碼子，使用補充稀有密碼子的菌株，在較低的溫度下誘導或在較差的培養(yǎng)基中生長
c. 蛋白質(zhì)毒性。您應該使用調(diào)控更嚴格的啟動子或較低的質(zhì)粒拷貝數(shù)。在基于T7系統(tǒng)的菌株中使用pLysS/pLysE菌株，或者選擇更適合表達毒性蛋白質(zhì)的菌株。在高OD值下開始誘導并縮短誘導時間。在使用含有Lac啟動子的表達載體時添加葡萄糖。
Q: 如何表達具有生物活性的蛋白質(zhì)？為什么蛋白質(zhì)無活性？
為了獲得具有生物活性的蛋白質(zhì)，您應選擇正確的表達系統(tǒng)、適當?shù)乇磉_載體、合適的純化方法以及驗證實驗。此外，您還可以檢查以下問題：
a. 蛋白質(zhì)的溶解度較低。您可以將所需的蛋白質(zhì)與融合伴侶融合，并降低溫度。
b. 缺乏必要的翻譯后修飾。您應選擇另一個表達系統(tǒng)。
c. 折疊不完整。您應使用融合伴侶，并使用具有冷適應分子伴侶的菌株。在較低溫度下與分子伴侶共同表達。監(jiān)測二硫鍵的形成，并允許進一步的體外折疊。
d. cDNA中的突變。您應在誘導前后測序質(zhì)粒，或使用recA－菌株確保質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在每次表達循環(huán)前轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
Q: 如何避免包涵體的形成并改善可溶性表達？
a. 高親水性或跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。您應該添加融合標簽或加入熱休克分子伴侶。在低溫下較短時間誘導表達，或者轉(zhuǎn)換至貧負載培養(yǎng)基。產(chǎn)生截短形式的蛋白質(zhì)或使用富含膜的菌株。
b. 錯誤的二硫鍵形成。您應該添加融合伴侶蛋白，包括巰基還原酶、DsbA和DsbC。克隆到含有分泌信號肽的質(zhì)粒中，使其分泌到細胞外腔。使用具有氧化型胞質(zhì)環(huán)境的gamiB (DE3）菌株。降低誘導劑濃度和誘導溫度。
c. 錯誤的折疊。您應該使用融合伴侶蛋白。與分子伴侶一同共表達。使用具有冷適應分子伴侶的菌株。向培養(yǎng)基中添加化學分子伴侶和輔因子。降低誘導劑濃度并添加新鮮培養(yǎng)基。在低溫下較短時間誘導表達。
Q: 為什么蛋白質(zhì)的分子量小于預測值？
可能存在的原因有：
a. 蛋白質(zhì)序列中包含罕見的氨基酸硒蛋白質(zhì)（Sec）或吡咯賴氨酸（Pyl）。您應該使用其他氨基酸來代替這兩種不常見的氨基酸。
b. 融合蛋白質(zhì)的翻譯過程不平衡。您應該更換其他的融合標簽或?qū)⑷诤蠘撕炓频紺端。在低溫下較短時間誘導表達，或者轉(zhuǎn)換至貧負載培養(yǎng)基。
c. 蛋白質(zhì)降解。您應該替換特定的蛋白酶位點。使用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下誘導表達。在低溫下較短時間誘導表達，或者在破碎細胞時使用蛋白酶抑制劑。
Q: 為什么實際的帶狀大小與預測值不同？
可能存在的原因有：
a. 翻譯后修飾。如磷酸化、糖基化等會增加蛋白質(zhì)的大小。
b. 翻譯后剪切。許多蛋白質(zhì)首先合成為前蛋白質(zhì)，然后通過剪切產(chǎn)生活性形式。
c. 剪接變體。剪接變異可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。
d. 相對電荷。氨基酸的組成具有不同的相對電荷，這會影響電泳遷移性。
e. 多聚體，例如蛋白質(zhì)的二聚化。通常在還原條件下會被阻止，盡管強烈的相互作用可能會導致出現(xiàn)較高的帶狀。
f. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如二硫鍵、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形成。
g. 疏水性蛋白質(zhì)，如跨膜蛋白質(zhì)，可能難以遷移到凝膠中，從而導致不同的多帶圖案。
Q: 如何重溶和儲存產(chǎn)品？
在打開蓋子之前，請先離心試劑管。
對于短期儲存或使用，請使用無菌去離子水將蛋白質(zhì)完全重溶至0.1-1.0 mg/mL。如有需要，重溶后經(jīng)過10—15分鐘后進行分裝，并儲存在4℃。
對于長期儲存，建議將細胞因子或重組蛋白添加5%-50%的甘油（最終濃度），并進行分裝以長期儲存在-20℃/-80℃。我們默認的甘油最終濃度為50%。客戶可以參考此濃度。
Q: CUSABIO使用哪些類型的標簽進行融合？
CUSABIO提供的常見標簽包括His-tag、FLAG-tag、GST-tag、MBP-tag、組合標簽（His-GST-tag、His-sumo-tag、His-MBP-tag）等。有時，在制造過程中會確定蛋白質(zhì)的標簽類型。如果您有指定的標簽類型，請隨時與我們咨詢。
Q: 給定的標簽類型會對蛋白質(zhì)的生物活性產(chǎn)生什么影響？
從理論上講，小的標簽對蛋白質(zhì)活性影響很小。然而，具體對蛋白質(zhì)活性的影響無法一概而論（有些蛋白質(zhì)沒有影響，有些蛋白質(zhì)有輕微影響，而有些蛋白質(zhì)可能有較大影響）。
Q: CUSABIO能去除內(nèi)毒素嗎？
并非所有的內(nèi)毒素都可以去除。如果您需要去除內(nèi)毒素，請?zhí)崆芭c我們溝通，該過程需要2～3個工作日。我們可以提供免費的內(nèi)毒素去除服務，使用PMB親和層析法，并使用LAL試劑進行半定量檢測，確保內(nèi)毒素水平在0.1 ng/μg（1 EU/μg）以內(nèi)。
Q: CUSABIO能提供無菌生產(chǎn)加工嗎？
是的，我們可以提供這項服務，而且是免費的，但您需要在下訂單時備注此信息。我們在凍干之前對液體蛋白進行了無菌處理，但在凍干過程中可能存在污染，因此無法保證整個過程是無菌的。
Q: 如何確定細胞因子的物種交叉反應性？
a. 除了少數(shù)例外情況外，大多數(shù)人類細胞因子在小鼠細胞上具有活性。
b. 許多小鼠細胞因子也可能對人類細胞產(chǎn)生影響，但其活性可能低于相應的人類細胞因子。
c. 少數(shù)人類細胞因子在作用于小鼠細胞時會比相應的小鼠細胞因子更活躍，例如IL-7。
d. 干擾素、GM-CSF、IL-3和IL-4等細胞因子是物種特異性的，幾乎對非同源細胞沒有活性。
e. 相比之下，成纖維細胞生長因子（FGF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子在不同物種的細胞上都具有良好的活性，它們高度保守。
Q: 通常使用的防腐劑是什么？通常添加哪種防腐劑？
常用的防腐劑包括Proclin 300、偶氮甲烷等。我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不添加任何防腐劑。
Q: 蛋白為什么要凍干？凍干對蛋白的影響有哪些？
蛋白質(zhì)對熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長保存時間，同時降低運費。
凍干有可能會造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問題。但可以通過添加保護劑（穩(wěn)定劑，添加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來盡可能降低這些負面的影響。
溫馨提示：武漢華美提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少1個月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃ ，以確保蛋白100%的活性。
Q: 凍干前為什么向蛋白溶液中加保護劑？一般凍干保護劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護劑是什么？
保護劑是用來在凍干和儲存過程中保護蛋白的。常用的保護劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物，表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%（質(zhì)量比體積）的海藻糖和甘露醇作為凍干保護劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；甘露醇也是一種普遍應用的凍干保護劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。
溫馨提示：對于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。
Q: 為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？
CUSABIO的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并以最低含鹽量的溶液進行凍干時，常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。
溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準確無誤，雖然有時您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白含量仍是非常精確的。
Q: 應如何確定細胞因子的種屬交叉活性？
1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細胞因子對小鼠細胞均有活性。2) 許多小鼠細胞因子也可作用于人類細胞，但比活性可能低于對應的人類細胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細胞因子作用于小鼠細胞時比對應的小鼠細胞因子活性更強。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細胞因子種屬特異，對非同源細胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細胞上均具有很好的活性。
Q: 應如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？
第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。
第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關，其中比較重要的是pH值和離子強度。產(chǎn)品說明上所標明的溶解液是能夠?qū)⒃摷毎蜃踊蛑亟M蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
2) 一定要溶解到指定的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時細胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。請用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進行分裝或使用。
第3步：該重懸液在2-8℃最長可保存1周。
用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
第4步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。
如果一個實驗周期長于一周，或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動物或人的蛋白，要想長期保存細胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
