蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）

日期：2024-01-31 09:02:59

人類基因組由 20,000 到 25,000 個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因組成 ^[1]，而人類蛋白質(zhì)組估計(jì)多達(dá) 1,000,000個(gè)蛋白質(zhì) ^[2]。為什么人類蛋白質(zhì)組的規(guī)模遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人類基因集？除了 mRNA 的替代剪接是蛋白質(zhì)多樣性的來源之外，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）也進(jìn)一步影響并增加了蛋白質(zhì)的變異性和復(fù)雜性。

根據(jù)生物學(xué)的 "中心法則"，DNA首先轉(zhuǎn)錄為RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)。然而，大多數(shù)蛋白質(zhì)在生物合成后還需要經(jīng)過一些額外的步驟，這些步驟是細(xì)胞、組織和生物體實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能和多樣性所必需的。蛋白質(zhì)翻譯后的這些酶修飾稱為PTM。

1. 什么是翻譯后修飾？

在生物合成之后，蛋白質(zhì)會(huì)通過各種方式進(jìn)一步調(diào)整，以完善其結(jié)構(gòu)、指定其空間方向或調(diào)節(jié)其活性。翻譯后修飾（PTMs）是指通過蛋白水解裂解以及在單個(gè)或多個(gè)氨基酸上添加功能基團(tuán)（如乙酰基、磷酸基和糖基）來改變蛋白質(zhì)特性的這些動(dòng)態(tài)的、緊密協(xié)調(diào)的加工事件 ^[3]。PTMs 經(jīng)常出現(xiàn)在分泌蛋白、膜蛋白、組蛋白和其他具有重要結(jié)構(gòu)/功能的蛋白質(zhì)中。它們出現(xiàn)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器中 ^[4]。PTMs 要么是共價(jià)修飾等可逆反應(yīng)，要么是蛋白水解修飾等不可逆反應(yīng)。

據(jù)估計(jì)，執(zhí)行各種PTM的酶占整個(gè)蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)的5%。這些酶包括激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)移酶和連接酶，它們可在氨基酸側(cè)鏈上添加或去除功能基團(tuán)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或糖，還包括蛋白酶，它們可從氨基酸側(cè)鏈上去除特定序列或調(diào)節(jié)亞基。

2. 翻譯后修飾的分類

目前已發(fā)現(xiàn)400多種不同形式的PTM。它們可根據(jù)被修飾氨基酸側(cè)鏈的類型、修飾酶的類別和可逆性程度進(jìn)行分類。研究最多的 PTM 包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化、SUMO化、脂化（棕櫚酰化、肉豆蔻酰化和前酰化）和硫化。

圖1. PTMs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)

圖片來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8072572/

表1：不同 PTM 的機(jī)制和功能

PTMs的類型				機(jī)制	靶向位置	功能
磷酸化			可逆	激酶將磷酸基團(tuán)從三磷酸腺苷轉(zhuǎn)移到受體殘基上	主要發(fā)生在目標(biāo)蛋白質(zhì)的 Ser、Thr、Tyr 和 His 殘基上，也可見于 Pro、Arg、Asp 和 Cys 殘基上。	參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等關(guān)鍵細(xì)胞過程。
乙酰化	Nα- 乙酰化		不可逆	乙酰轉(zhuǎn)移酶使用乙酰 CoA 作為輔助因子，將乙酰基（COCH3）添加到賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基上。	報(bào)告較多的是賴氨酸殘基，但也發(fā)生在賴氨酸、Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Met、Pro、Ser、Thr 和 Val 殘基上。	在染色質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞代謝、核運(yùn)輸和肌動(dòng)蛋白成核等生物過程中發(fā)揮重要作用 [5] [6]。
	Nε-乙酰化		可逆
	O-乙酰化		可逆
泛素化			可逆	活性泛素蛋白的 C 端與蛋白賴氨酸殘基的 Nε 之間發(fā)生共價(jià)鍵合。	出現(xiàn)在所有 20 個(gè)氨基酸上，但更多出現(xiàn)在賴氨酸上。	在所有組織中主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
甲基化			可逆	在目標(biāo)蛋白質(zhì)的賴氨酸或精氨酸殘基上添加甲基。	發(fā)生在目標(biāo)蛋白質(zhì)的 Lys、Arg、Ala、Asn、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Leu、Met、Phe 和 Pro 殘基上。	最常見于組蛋白修飾。與各種生物過程的微調(diào)有關(guān)，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控到通過異染色質(zhì)組裝的表觀遺傳沉默。
糖基化	N-糖基化		可逆	N 連接的聚糖與天冬酰胺或精氨酸側(cè)鏈的氮相連。	較常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)和脂蛋白中的 Ser、Thr、Asn 和 Trp 殘基上，但也會(huì)出現(xiàn)在 Ala、Arg、Asp、Ile、Lys、Val、Glu、Pro、Tyr、Cys 和 Gly 殘基上。	參與細(xì)胞粘附、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、分子販運(yùn)、受體激活、蛋白質(zhì)溶解度效應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解以及蛋白質(zhì)胞內(nèi)販運(yùn)和分泌 [7-9]。
	O-糖基化			O 鍵聚糖連接到絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥基賴氨酸或羥基脯氨酸側(cè)鏈的羥基氧上，或連接到神經(jīng)酰胺等脂質(zhì)上的氧原子上。
	C-糖基化			色氨酸側(cè)鏈的碳上添加了糖。
	磷酸-糖基化			磷酸聚糖通過磷酸絲氨酸的磷酸鹽連接。
	糖化			引入 GPI 錨點(diǎn)，通過糖鏈將蛋白質(zhì)與脂質(zhì)連接起來。
SUMO酰化			可逆	SUMO（SUMO1、SUMO2和SUMO3）通過三種酶，即SAE1（激活）、UBC9（共軛）和連接酶PIAS1，以共價(jià)連接的方式與底物蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基相連。	賴氨酸殘基	是維持細(xì)胞中基因組完整性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件 [10]。調(diào)控 DNA 損傷修復(fù)、免疫反應(yīng)、致癌、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞凋亡。
脂化	棕櫚酰化		可逆	通過硫酯連接將棕櫚酸酯與半胱氨酸進(jìn)行共價(jià)加成。	發(fā)生在 Cys、Gly、Ser、Thr 和 Lys 殘基上。	在蛋白質(zhì)功能調(diào)控、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、膜-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)、神經(jīng)元發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和有絲分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用 [11]。
	肉豆蔻酰化		不可逆	肉豆蔻酸通過共價(jià)鍵與 N 端甘氨酸殘基相連。	在甘氨酸上出現(xiàn)的頻率較高，而在賴氨酸上出現(xiàn)的頻率較低。	調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的成熟、信號(hào)傳遞、細(xì)胞外通訊、新陳代謝和酶的催化活性。
	異戊烯酰化	法呢酰化	不可逆	法呢酰焦磷酸加到半胱氨酸殘基上。	出現(xiàn)在半胱氨酸和底物蛋白質(zhì)的羧基末端附近。	促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用、內(nèi)吞調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和蛋白質(zhì)販運(yùn)。
	異戊烯酰化	麥角酰化	不可逆	在半胱氨酸殘基上添加焦磷酸香葉酯。	出現(xiàn)在半胱氨酸和底物蛋白質(zhì)的羧基末端附近。
硫化			不可逆	TPST1 或 TPST2 可將活化的硫酸鹽從 3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸鹽轉(zhuǎn)移到多肽酸性基團(tuán)內(nèi)的酪氨酸殘基上	發(fā)生在目標(biāo)蛋白質(zhì)的 Tyr、Cys 和 Ser 上。	在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用、白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)、視覺功能和病毒進(jìn)入細(xì)胞等方面起著至關(guān)重要的作用。

圖2. 蛋白質(zhì)的磷酸化

圖3. SUMO化催化循環(huán)

圖片來源：https://www.caister.com/cimb/v/v40/189.pdf

圖4. 蛋白質(zhì)的泛素化過程及其降解

圖片來源：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02738/full

3. 翻譯后修飾的生物學(xué)意義

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTMs）在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，它使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，蛋白質(zhì)功能更加完善，調(diào)控更加精細(xì)，蛋白質(zhì)的作用更加特異。PTM通過拓寬修飾氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)范圍，擴(kuò)大了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可變性和多樣性，并引入了新的功能 ^[12]。由于不同的PTM可導(dǎo)致蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的不同改變 ^[13]，因此不同的修飾可賦予同一蛋白質(zhì)不同的功能。一個(gè)蛋白質(zhì)可以有不同種類和數(shù)量的PTM。

PTM 對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響是多方面的。它們可能會(huì)影響酶的功能和組裝 ^[14]、蛋白質(zhì)的活性、蛋白質(zhì)的壽命、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用 ^[15]、細(xì)胞-細(xì)胞/基質(zhì)之間的相互作用、分子遷移、受體活化、蛋白質(zhì)的可溶性 ^[16-18]、蛋白質(zhì)的折疊 ^[19]、蛋白質(zhì)的位置、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的親電性等蛋白質(zhì)的行為和特性。因此，這些修飾在多種生物過程中發(fā)揮作用，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ^{[20] [21]}、基因表達(dá)調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞存活和細(xì)胞周期控制。

4. 翻譯后修飾的檢測(cè)

檢測(cè)翻譯后修飾，了解它們?nèi)绾伟l(fā)揮作用、影響蛋白質(zhì)組和控制基因組，將極大地推動(dòng)我們對(duì)遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的理解。PTM 鑒定對(duì)于闡明復(fù)雜細(xì)胞過程和疾病的機(jī)理非常重要。檢測(cè) PTM 的實(shí)驗(yàn)方法有很多，包括 Western 印跡（WB）、反相蛋白質(zhì)陣列（RPA）、基于免疫沉淀（IP）的方法、質(zhì)譜（MS）、體外檢測(cè)和免疫熒光。這些方法在易用性、復(fù)雜性、成本和結(jié)果交付方面存在很大差異。可以將兩種或多種方法結(jié)合起來，對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)的 PTM 進(jìn)行鑒定、驗(yàn)證和機(jī)理表征。

表2：不同PTM檢測(cè)方法之間的差異

方法	原理	優(yōu)勢(shì)	劣勢(shì)
免疫印記（Western blotting，WB）	在丙烯酰胺凝膠中根據(jù)分子量從復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中分離出不同的蛋白質(zhì)，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，用針對(duì)所選 PTM 的一抗和二抗進(jìn)行印跡。	可研究 PTM 的內(nèi)源性改變。無需特定工具。	需要針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體。沒有位點(diǎn)特異性。由于 PTM 修飾可能會(huì)阻斷目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此可能出現(xiàn)假陰性。
反相蛋白質(zhì)陣列（RPA）	使用一種將細(xì)胞裂解液固定在小點(diǎn)上的平臺(tái)，允許特異性識(shí)別相關(guān) PTM 的抗體對(duì)預(yù)選蛋白質(zhì)的 PTM 進(jìn)行定量。	這是一種基于抗體的靈敏蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本集的多種蛋白質(zhì)和翻譯后修飾進(jìn)行定量。相對(duì)較高的重現(xiàn)性、靈敏度和穩(wěn)健性。	需要事先篩選抗體并驗(yàn)證其特異性。收集樣本和打印粘性樣本的能力是 RPA 技術(shù)的一個(gè)局限。
基于免疫沉淀 (IP）的方法	固定在固體支持基質(zhì)（如瓊脂糖樹脂）上的抗體與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合，而復(fù)合裂解物中的其他蛋白質(zhì)則被洗去。使用洗脫緩沖液洗脫捕獲的蛋白質(zhì)，并將其濃縮分離。分離出的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步進(jìn)行 WB 或 MS 分析。	適用于富集感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)上特定的、低豐度的 PTM。經(jīng)過優(yōu)化的高質(zhì)量 IP 試劑可提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。	進(jìn)一步分析需要其他方法，如 WB 或 MS。
質(zhì)譜分析法（MS）	用特定的蛋白酶（通常是胰蛋白酶）消化感興趣的蛋白質(zhì)裂解物，富集特定的 PTM，然后用 LC-MS/MS 進(jìn)行分析。收集數(shù)據(jù)后，利用計(jì)算算法識(shí)別肽和蛋白質(zhì)及其相對(duì)定量。用于檢測(cè) PTMs 底物和繪制 PTMs 位點(diǎn)圖。	可檢測(cè)大量修飾蛋白質(zhì)，靈敏度和特異性高。	耗時(shí)且具有高度的 PTM 特異性。需要質(zhì)譜儀和熟悉操作儀器的相關(guān)專家。質(zhì)譜儀的局限性和偏差。
免疫熒光（IF）	可用于研究組織或細(xì)胞中 PTM 特征的整體和空間變化。可能是一種有用的生物讀數(shù)。	可用于檢查蛋白質(zhì)在整個(gè)細(xì)胞中的定位，并確定蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞條件下的特定形式的定位。	不能用于鑒定特定目標(biāo)的 PTM。

5. 翻譯后修飾對(duì)疾病的影響

翻譯后修飾幾乎影響正常細(xì)胞生物學(xué)的所有方面，并對(duì)各種分子功能進(jìn)行微調(diào)。PTMs 的失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、分化和凋亡等重要生物過程的功能障礙，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，識(shí)別和了解 PTMs 對(duì)細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病治療和預(yù)防至關(guān)重要。

磷酸化途徑的紊亂與癌癥、心臟病、阿爾茨海默病和帕金森病等疾病有關(guān) ^[22]。SUMOylation 會(huì)影響癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)炎癥、免疫和 DNA 損傷，在致癌、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡之間建立聯(lián)系。乙酰化賴氨酸失調(diào)可導(dǎo)致癌癥、衰老、免疫問題、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等嚴(yán)重疾病 ^{[5] [23] [24]}。泛素途徑的功能障礙可導(dǎo)致多種疾病，如不同的癌癥、代謝綜合征、炎癥性疾病、2 型糖尿病和神經(jīng)退行性疾病 ^{[25] [26]}。甲基化缺陷可導(dǎo)致多種疾病，如癌癥、智力遲鈍（安吉爾曼綜合征）、糖尿病、脂質(zhì)沉著病和閉塞性疾病 ^{[27] [28]}。糖基化缺陷在癌癥、肝硬化、糖尿病、艾滋病病毒感染、老年癡呆癥和動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)病過程中起著重要作用 ^{[9] [29]}。棕櫚酰化功能障礙與許多疾病相關(guān)，包括亨廷頓氏病、精神分裂癥和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及不同的癌癥 ^[30-32]。前酰化紊亂是癌癥、心腦血管疾病、骨病、早衰癥、代謝性疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制之一。

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