納米抗體，強大的新型抗體!
日期：2023-12-26 09:04:49
隨著全球范圍內COVID-19的爆發，我們迫切需要安全有效的抗病毒抗體作為對抗新冠病毒（SARS-CoV-2）的新藥物和治療選擇。談到治療性抗體時，單克隆抗體（mAb）會浮現在我們的腦海中。確實，單克隆抗體（mAb）是制藥業中最大且增長最快的領域之一。在SARS和MERS爆發期間，一些中和性單克隆抗體被開發出來，并確認其在治療冠狀病毒感染方面的潛力。然而，它們的臨床應用仍受制于耗時昂貴的真核系統抗體生產過程。在這里，我們專注于一種針對mAb缺陷開發的新型抗體。這是一種由駱駝免疫球蛋白制成的單域抗體，也稱為VHH或納米抗體。那么，什么是納米抗體？納米抗體有哪些優勢？
1. 納米抗體的發現
納米抗體（Nbs）以其小分子量和獨特的分子結構而特點明顯。這些特點使得它們在疾病診斷和治療等許多領域中具有廣泛的應用前景。
納米抗體是在20世紀80年代被發現的。當時，兩名大學生向比利時布魯塞爾自由大學的免疫學教授Hamers抱怨實驗課程的結果已經被知曉，不具有挑戰性。于是，Hamers教授將冰箱中剩余的半升睡眠病駱駝血液交給了Muyldermans等人，告訴他們嘗試從中提純出駱駝抗體。Muyldermans等人驚訝地發現，從駱駝血液中提純出的某些抗體并不屬于所有脊椎動物的標準類型，而是一種全新的、更簡單的變異抗體。這一結果讓每個人都感到困惑。Hamers教授隨即組建了一個研究團隊，對這種抗體進行了專門的研究。從那時起，駱駝抗體從一個學生的實驗迅速演變為Hamers教授及其同事研究的主要項目。在1993年，Hamers等人首次在《Nature》雜志上報告了駱駝和鯊魚中存在一種天然缺乏輕鏈的重鏈抗體（HcAb）[1]。與傳統的單克隆抗體相比，駱駝抗體除了缺少輕鏈外，在重鏈變異區和鉸鏈區之間沒有CH1區，只有一個重鏈變異區（VHH）和兩個傳統的CH2和CH3區。這個VHH被稱為納米抗體。關于納米抗體的結構，我們將在下一節介紹。
2. 納米抗體的定義
納米抗體（Nbs），也稱為VHH抗體，是一種來源于羊駝重鏈IgG抗體（HCAb）的單一變異區域抗體，位于重鏈上。Nbs通常被視為傳統抗體的一種替代品，并且在生產和使用方面存在顯著的差異，這些差異影響了它們的適用性。Nbs和傳統抗體之間的主要區別與它們的結構和領域有關。如圖1所示，傳統抗體具有兩個變異區域，分別稱為VH和VL，它們相互提供穩定性和結合特異性。Nbs具有VHH領域并且缺少VL領域，但仍然具有很高的穩定性。缺少VL領域還意味著Nbs具有親水性的一側。
圖1. 抗體和抗體片段的結構和示意圖
*圖片來源于發表在《肛門生物肛門化學》上的出版物 [2]
重鏈抗體的VHH片段與傳統抗體的VH特性不同，但獨立克隆和表達的VHH結構具有與原始重鏈抗體相當的結構穩定性和與抗原的結合活性，目前已知可以結合目標抗原的最小單位[3]。結構分析結果顯示，VHH晶體寬度為2.5納米，長度為4.8納米，其分子量僅約為15KDa。
3. 納米抗體的生產過程
納米抗體（Nbs）越來越受到歡迎，作為研究試劑，越來越多的論文在文獻中使用了Nbs。在2018年9月3日，EMA批準了賽諾菲公司的納米抗體藥物（Caplacizumab，又稱Cablivi），用于治療成人獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）。Cablivi成為首個特異性aTTP治療藥物，也是首個上市的納米抗體藥物。
隨著首個納米抗體藥物的批準，如何大規模生產穩定的Nbs成為急需解決的問題。目前，免疫文庫是生產Nbs的最常見選擇。如圖2所示，可以通過使用免疫原進行主動免疫或使用未免疫的駝科動物（如駱駝、單峰駝、美洲駝或羊駝）采集含有淋巴細胞的血液來獲得遺傳信息。一旦特定序列被擴增并插入克隆載體，就可以通過噬菌體展示技術進行篩選過程，以分離出最合適的Nbs，或使用其他方法，如細胞表面展示、mRNA/cDNA展示或質譜鑒定等方法[4]。進行這種篩選的最常用策略是基于噬菌體展示選擇。
圖2. 使用噬菌體展示庫的納米抗體生產方案
*圖片來源于發表在《肛門生物肛門化學》上的出版物 [2]
4. 納米抗體的優勢
納米抗體（Nbs）的獨特特性使其在許多方面相比傳統抗體具有顯著優勢。它們將單克隆抗體的理想特性與小分子藥物的一些有益特性相結合。
Nbs在高溫條件下具有很強的穩定性，能夠保持生物活性，便于運輸和儲存。此外，Nbs在強酸和強堿條件下也很穩定，因此可以制備口服制劑，而傳統抗體在高溫、強酸和強堿條件下容易分解，需要低溫儲存[5] [6]；
由于其結構特點，Nbs可以深入到抗原的內部[7]，因此它們可以識別傳統抗體無法接觸到的抗原；
Nbs非常小，可以進入腫瘤組織內部完全清除腫瘤，還可以通過血腦屏障進入腦組織[8]。傳統抗體的分子量是Nbs的十倍，組織滲透性較差；
Nbs的結構簡單，可以在大腸桿菌和酵母等較簡單的微生物系統中大規模生產，從而顯著降低研發和生產成本，并解決抗體制品的大規模制備問題。
然而，Nbs作為體外診斷試劑仍存在一些障礙。由于Nbs的分子量較小，它們的結構在用于臨床診斷試劑的開發之前需要進行修飾。然而，常用的結構修飾技術會對Nbs的生物活性產生負面影響，從而嚴重限制了納米抗體產品的應用。
5. 納米抗體的應用
Nbs具有許多有趣的應用，其中許多尚處于早期階段的開發。這些應用包括基礎研究和臨床治療。這些應用主要分為三個部分，涉及研究、診斷和治療。
5.1 在研究中的納米抗體應用
? Nbs作為親和捕獲試劑：與較大的抗體格式相比，由于其小尺寸和單一域格式，Nbs具有更高的親和力結合表面和較低的非特異性背景結合。通過其單價的結合方式，它們可以在溫和條件下被洗脫，其高穩定性允許重復使用[9] [10]。
? Nbs作為晶體化引導蛋白：由于Nbs能夠將蛋白質鎖定在特定構象中，穩定柔性結構域并將聚集表面屏蔽在溶劑中，因此Nbs在晶體化具有良好的表現[11] [12]。它們已在許多蛋白質晶體化研究中使用，并且這些相同的特性也被用來穩定淀粉樣β前纖維和防止成熟淀粉樣纖維的形成。
? 細胞內靶標成像和免疫調節：在細胞內起作用的抗體被稱為“細胞內抗體”。由于Nbs在還原性細胞內環境中也能非常好地折疊成功能性實體，Nbs與融合的熒光蛋白一起在細胞內表達，可以用于跟蹤其在活細胞中的抗原活性[13]。它們還可以用于功能性地敲除細胞中的抗原，并融合信號肽以定位到特定的亞細胞區域。
5.2 在診斷中的納米抗體應用
? Nbs作為新型生物傳感器中的探針：可以在醫學、環境和食品分析領域中用于生物傳感器。它們的特異性功能基序容易引入，其小尺寸允許高容量的結合表面，從而提高了靈敏度。
? 用于非侵入性體內成像的Nbs：由于其小尺寸，Nbs可用作非侵入性分子成像的示蹤劑，用于研究疾病過程，可實現快速組織穿透和血液清除。
5.3 在治療中的納米抗體應用
? Nbs在抗毒素治療中的應用：目前正在使用多克隆免疫球蛋白片段制備抗毒素，其效力低且不穩定。此外，它們還具有嚴重的不良影響。Nbs的小尺寸使它們可以在體內擴散，并與小毒素的生物分布相匹配，當納米抗體捕獲毒素后，復合物仍然足夠小，可以通過腎臟迅速排除。
? 抗感染的納米抗體：可以作為抗細菌、病毒和寄生蟲感染的藥物進行開發。針對呼吸道合胞病毒的Nbs的I期臨床試驗表明，Nbs可以抵抗感染。Nbs不具有傳統抗體的Fc區域，因此它們不會中和和消除病原體。然而，它們具有自身固有的中和作用。
? 基于免疫的治療中的Nbs：可以通過抑制配體-受體相互作用，如拮抗抗von Willebrand因子以阻止血栓形成的啟動，或抑制抗TNF-α以治療關節炎等方式，用于對抗癌癥和其他疾病。
6. 納米抗體在SARS-CoV-2治療中的最新進展
在本部分，我們收集了幾個關于納米抗體在SARS-CoV-2治療中的最新研究進展，如下所示：
? 2020年5月5日，Jason S. McLellan等人在《Cell》雜志上發表了題為“Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies”的研究。該研究發現，他們從用預穩定的冠狀病毒棘蛋白免疫的駱駝體內分離出了單域抗體（VHHs）。這些VHHs能夠中和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（MERS-CoV）或嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒1（SARS-CoV-1）的S假型病毒。該研究還表明，針對SARS-CoV-1 S的VHH和SARS-CoV-2 S之間存在交叉反應，并證明這種交叉反應的VHH以雙價人類IgG Fc融合體的形式中和了SARS-CoV-2 S假型病毒。這些研究結果為通過VHH中和致病性冠狀病毒提供了分子基礎，并暗示這些分子在冠狀病毒爆發期間可能作為有用的治療藥物[14]。
? 2020年5月14日，中國復旦大學的研究人員在《Cell Host & Microbe》雜志上在線發表了題為“Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2”的論文。研究人員成功建立了一個噬菌體展示的人類單域抗體文庫。這個多功能平臺可以迅速分離人類納米抗體（Nbs）并篩選SARS-CoV-2抗體。Nbs不僅可以單獨使用，還可以與其他抗體合作；小尺寸的特性也成為構建雙特異性或多特異性抗體的理想模塊，有效防止病毒逃逸突變的出現以及許多其他優勢。因此，這些全人源納米抗體有望成為臨床治療COVID-19的有效預防和治療藥物[15]。
? 2020年6月6日，中國的一個科研團隊在《Cell》雜志上在線發表了題為“Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2”的研究。他們報告了一種規模試驗性生產的滅活SARS-CoV-2疫苗候選劑（BBIBP-CorV），該疫苗能夠在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物中誘導高水平的中和抗體效價，從而提供對SARS-CoV-2的保護。此外，BBIBP-CorV在疫苗制造方面具有高效的生產能力和良好的遺傳穩定性。這些結果支持進一步在臨床試驗中評估BBIBP-CorV的價值[16]。
參考文獻：
[1] Hamers-Casterman, C., T. Atarhouch, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains [J]. Nature. 1993, 363:446-448.
[2] J.-Pablo Salvador & Llu?sa Vilaplana. Nanobody: outstanding features for diagnostic and therapeutic applications [J]. Bioanal Chem. 2019.
[3] Cui Li, Zhuoran Tang, et al. Natural Single-Domain Antibody-Nanobody: A Novel Concept in the Antibody Field [J]. J Biomed Nanotechnol. 2018. 14:1-19.
[4] Liu W, Song H, et al. Recent advances in the selection and identification of antigen-specific nanobodies [J]. Mol Immunol. 2018, 96:37–47.
[5] Perez JM, Renisio JG, et al. Thermal unfolding of a llama antibody fragment: a two-state reversible process [J]. Biochemistry. 2001, 40(1):74–83.
[6] Dumoulin M, Conrath K, et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability [J]. ProteinSci. 2002, 11(3):500–15.
[7] Conrath KE, Lauwereys M, et al. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae [J]. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45(10):2807–2812.
[8] McMurphy T, Xiao R, et al. The anti-tumor activity of a neutralizing nanobody targeting leptin receptor in a mouse model of melanoma [j]. PLoS One. 2014, 9(2):e89895.
[9] Verheesen P, Ten Haaft MR, et al. Beneficial properties of single-domain antibody fragments for application in immunoaffinity purification and immuno-perfusion chromatography [J]. Biochim. Biophys. Acta. 2003, 1624(1–3), 21–28.
[10] Gholamreza HassanzadehGhassabeh, Nick Devoogdt, et al. Nanobodies and their potential applications [J]. Nanomedicine. 2013, 8(6): 1013–1026.
[11] Baranova E, Fronzes R, et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 2012, 487(7405):119–122.
[12] Rasmussen SGF, Choi H-J, et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor [J]. Nature. 2011, 469(7329): 175–180.
[13] Ries J, Kaplan C, et al. A simple, versatile method for GFPbased super-resolution microspcopy via nanobodies [J]. Nat. Methods. 2012, 9(6), 582–584.
[14] Daniel Wrapp, Dorien De Vlieger, et al. Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies [J]. Cell. 2020, 181(5): 1004-1015.
[15] Yanling Wu, Cheng Li, et al. Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2 [J]. Cell Host & Microbe. 2020, 27(6):891-898.
[16] Hui Wang, Yuntao Zhang, et al. Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2 [J]. Cell. 2020.
