實驗技術|蛋白免疫印跡WB（下）

日期：2019-03-27 09:38:53

科研就像賽跑，你比別人跑的快，就比別人多發幾篇SCI~

前兩期，給朋友們帶來了

實驗技術|蛋白免疫印跡WB（上）

實驗技術|蛋白免疫印跡WB（中）

做了很久的WB，走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應的解決方案，才是實驗成功的基石。

蛋白免疫印跡（WB）是基于抗原抗體的特異性結合作用，以檢測復雜樣品中的某種蛋白，并對其進行半定量分析的一種方法。

主要用于靶標蛋白特異性表達的定性或半定量分析，蛋白與蛋白或蛋白與DNA相互作用的后續分析，以及蛋白修飾的鑒定分析。

常見問題分析

1.為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？

原因有很多：

a) 細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；

b) 細胞中的蛋白質被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；

c) 抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；

d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長。

2.我做的蛋白質分子量很小（10 kDa），請問怎么做WB？

a)可以選擇PSQ膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可；

b)也可選擇孔徑0.22 μm的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。

3.我的目的帶很弱，如何加強？

a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；

b)也可以將一抗稀釋比例降低；

c)還可以延長曝光時間。

4.DAB好還是ECL好？

DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；

ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。

5.膠片是一片空白，是怎么回事？

如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；

b) ECM底物中H₂O₂，不穩定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；

d) 一抗選擇不當二抗失活；

e) 二抗失活。

6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

7.細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？

一般5×10^6就足夠。

8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？

可以濃縮樣品，也可以根據目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5 mm的。

9.大分子量蛋白200 kDa，在做WB要注意什么？

a) 做200kDa蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；

b) 轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。

c) 轉膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高哦!

10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？

免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

11.WB中抗體的可以重復應用嗎？

抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4℃保存，避免反復凍融。

12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果？

無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。

原因分析及解決辦法