【干貨收藏貼】WB常見問題精品全集錦
日期：2017-12-19 13:31:31
做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案，這就是實(shí)驗(yàn)成功的基石。 以下，我們先解決很多技術(shù)菌的疑惑，然后再著手匯總實(shí)驗(yàn)中常見問題和可能原因分析以及給出建議解決方案。 靜心閱讀十分鐘 實(shí)驗(yàn)問題全想通 WB常見問題分析
1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
原因有很多：
a) 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
b) 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；
c) 抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；
d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長。
2.我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KDa），請問怎么做WB？
a)可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；
b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。
3.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？
a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；
b)也可以將一抗稀釋比例降低；
c)還可以延長曝光時(shí)間。
4.DAB好還是ECL好？
DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級(jí)抗原。
5.膠片是一片空白，是怎么回事？
如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；
d) 一抗選擇不當(dāng)二抗失活；
e) 二抗失活。
6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
7.細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？
一般5×106就足夠。
8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？
a) 做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；
b) 轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
c) 轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!
10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
11.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？
抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。
12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？
無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。
WB 實(shí)驗(yàn)中常會(huì)出現(xiàn)各種問題，華美生物專注于生產(chǎn)免疫檢測相關(guān)產(chǎn)品多年，同時(shí)也跟技術(shù)菌們一起分享下 WB 實(shí)驗(yàn)中各種問題及應(yīng)用對策，希望給您的實(shí)驗(yàn)帶來實(shí)實(shí)在在的幫助~
WB問題匯總及解決建議
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
| 條帶形狀不好看 | 膠凝的不均勻，聚合不好 | 灌膠前將溶液充分混勻 |
| 某些樣品鹽濃度較高 | 除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致 | |
| 緩沖液陳舊，成分改變 | 重配 | |
| 凝膠下面有氣泡 | 電泳前先將氣泡趕走 | |
| 電泳時(shí)溫度過高 | 降低電流或電壓 | |
| 樣品中含有不溶性顆粒 | 樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span> | |
| 電極不平衡或者加樣位置偏斜 | 調(diào)整電極和加樣 | |
| 蛋白條帶信號(hào)弱 | 樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低 | 加大上樣量或濃縮樣品 |
| 轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移 | 可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流 | |
| 抗體濃度低 | 增加抗體濃度或延長孵育時(shí)間 | |
| 封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型 | |
| 顯色劑失效 | 更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用） | |
| 顯色或曝光時(shí)間不足 | 延長顯色或曝光時(shí)間 | |
| HRP 抑制劑 | 所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉 | |
| 轉(zhuǎn)膜效率低 | 轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)相近 | 提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值 |
| 凝膠與膜之間存在氣泡 | 轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡 | |
| 轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當(dāng) | 使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜 | |
| 電壓或電流過小 | 濕轉(zhuǎn)時(shí)20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時(shí)25V左右恒壓 | |
| 轉(zhuǎn)印時(shí)間過長或過短 | 根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時(shí)間 | |
| 濕轉(zhuǎn)過程中環(huán)境溫度過高 | 使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度 | |
| 顯色或曝光后無條帶 | 選用的一抗、二抗及顯色方法不合適 | 選擇合適的一抗、二抗和顯色方法 |
| 目的蛋白含量低于檢測下限 | 加大上樣量或濃縮樣品 | |
| 抗體效價(jià)過低 | 增加抗體濃度 | |
| 抗體孵育時(shí)間不足 | 延長孵育時(shí)間，37°C孵育1小時(shí)以上 | |
| 抗體過度洗滌 | 減少洗滌時(shí)間及次數(shù)，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多 | |
| 加入HRP底物反應(yīng)與曝光檢測之間間隔時(shí)間過長 | 反應(yīng)3到5分鐘及時(shí)檢測 | |
| 背景高 | 膜沒有完全均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數(shù) | |
| 封閉物用量不足 | 提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜 | |
| 封閉物使用不當(dāng) | 檢測生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉 | |
| 封閉時(shí)間不夠 | 室溫37度封閉1小時(shí)以上，4度封閉過夜 | |
| 抗體非特異性結(jié)合 | 降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間 | |
| 一抗稀釋度不適宜 | 對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度 | |
| 一抗孵育的溫度偏高 | 建議4℃結(jié)合過夜 | |
| 抗體濃度過高或洗滌不夠 | 降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間 | |
| 化學(xué)顯色底物過多 | 按說明書加入適量的顯色底物 | |
| 蛋白條帶位置 （大小）不對 |
相對電荷 | 氨基酸電荷的組成 |
| 膠濃度 | 不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，調(diào)整濃度 | |
| 抗體孵育不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間 | |
| 酶失活 | 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 | |
| 目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體 | 查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定 | |
| 標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設(shè)置陽性對照比對結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量 | |
| 雜帶多 | 目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶 | 查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小 |
| 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 | 加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作 | |
| 雜蛋白多 | 處理目的蛋白 | |
| 抗體特異性不強(qiáng) | 使用特異性強(qiáng)的抗體 | |
| 抗體孵育時(shí)間過久 | 減少抗體孵育時(shí)間 | |
| 二抗與抗原有交叉反應(yīng) | 選擇合適的封閉物 | |
| 二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 | |
| 底物顯色與曝光時(shí)間過長 | 縮短顯色及曝光的時(shí)間 | |
| 大分子量WB | 膜孔徑太小 | 更換孔徑較大的膜 |
| 轉(zhuǎn)膜電壓電流低 | 提高電壓/電流 | |
| 轉(zhuǎn)膜時(shí)間短 | 延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間 | |
| 膠濃度太大 | 使用低濃度的膠 | |
| 轉(zhuǎn)膜緩沖液配方不合適 | 調(diào)整轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇及SDS濃度 | |
| 背景有黑色斑點(diǎn) | 抗體與封閉試劑反應(yīng) | 使用前過濾封閉試劑 |
| HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
| 暗背景上白色帶 | HRP 含量過高 | 降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
| 背景有不均勻的白色斑點(diǎn) | 抗體分布不均勻 | 孵育抗體時(shí)使用搖床 |
順便給大家來幾張華美在實(shí)驗(yàn)中的WB圖~
各位看官，覺得如何？
又是滿受益吧~
so~
干貨別獨(dú)享~轉(zhuǎn)發(fā)帶分享~
