內源性ChIP和外源性ChIP對抗體的要求有什么不同？

日期：2025-04-28 15:51:00

內源性ChIP（Endogenous ChIP）和外源性ChIP（Exogenous ChIP）是根據目標蛋白是否為細胞 / 組織中天然表達（內源性）或通過外源導入（如轉基因、質粒轉染表達）來區分的。兩者在抗體選擇和實驗設計上有顯著差異，核心區別如下：

一、內源性ChIP對抗體的要求

1. 抗體需識別天然狀態的目標蛋白

（1）關鍵需求：內源性蛋白以天然構象存在，抗體需識別其在染色質上的原位表位（In situ epitope），該表位可能因翻譯后修飾（如磷酸化、乙酰化）或與其他蛋白結合而被遮蔽。

（2）具體要求：

?必須為ChIP級抗體：需經過 ChIP實驗驗證（如廠商標注 “ChIP validated”），確保能識別甲醛交聯后暴露的表位。

?優先選擇識別修飾位點的抗體：

♦若研究組蛋白修飾（如 H3K4me3），需使用特異性識別該修飾位點的抗體，而非總組蛋白抗體。

♦若研究轉錄因子，需確認抗體識別的表位不在 DNA 結合域內（避免表位被遮蔽），或通過預實驗驗證結合效率。

2. 抗體需兼容低豐度蛋白

（1）挑戰：內源性蛋白（尤其是轉錄因子）豐度較低，且與 DNA 結合可能為瞬時或低親和力，需抗體具備高靈敏度和親和力。

（2）解決方案：

?選擇高滴度抗體：通過廠商提供的免疫原濃度、抗體效價數據篩選（如 ELISA 效價 >1:10^6）。

?增加起始細胞量（如 1×10^7 個細胞）或采用預富集步驟（如通過核分離富集目標蛋白）。

3. 嚴格控制背景信號

（1）風險：內源性蛋白可能存在非特異性結合或與其他染色質成分交叉反應，需依賴抗體特異性排除干擾。

（2）措施：

?使用單克隆抗體：減少多克隆抗體因識別多個表位導致的非特異性結合。

?搭配嚴格的陰性對照：

♦同物種 IgG 對照，排除抗體 - 磁珠的非特異性吸附；

♦檢測已知不結合區域（如基因間區）的引物，驗證信號特異性。

二、外源性 ChIP 對抗體的要求

1. 抗體可識別標簽蛋白或外源表位

（1）核心策略：外源蛋白通常通過轉基因或質粒轉染表達，并攜帶標簽序列（如 Flag、HA、Myc、GFP 等），抗體直接識別標簽而非天然蛋白。

（2）優勢：

?標簽表位結構明確，不受蛋白修飾或結合狀態影響，抗體特異性更高（如抗 Flag M2 抗體已廣泛驗證用于 ChIP）。

?可通過過表達外源蛋白提高目標抗原豐度，降低對抗體靈敏度的依賴。

2. 對抗體的 ChIP 兼容性要求較低

（1）例外情況：若標簽蛋白在交聯后表位被遮蔽（如胞內定位的 GFP 標簽被蛋白折疊掩蓋），仍需驗證抗體的 ChIP 適用性。

（2）操作建議：

?優先選擇標簽特異性 ChIP 抗體（如 anti-Flag ChIP 抗體），或通過預實驗測試普通標簽抗體（如 WB 用抗體）是否適用于 ChIP。

?若標簽位于蛋白末端（如 N 端或 C 端），通常更易被抗體識別；若位于中間區域，可能因空間位阻影響結合。

3. 需注意外源表達的潛在干擾

（1）風險：外源蛋白過表達可能導致非生理狀態的結合（如異常聚集或招募），需通過內源性對照驗證結果可靠性。

（2）抗體選擇補充：若同時檢測內源和外源蛋白，可搭配使用內源抗體（如抗天然蛋白抗體）和標簽抗體，對比兩者富集結果的一致性。

三、關鍵差異總結