單克隆抗體的純化工藝流程步驟
日期:2023-06-27 15:36:33
單克隆抗體的純化工藝流程通常包括以下步驟:
一、細胞培養和收獲:
1. 將表達單克隆抗體的細胞(通常是哺乳動物細胞株)培養在適當的培養基中。
2. 監測細胞密度和生長情況,確保達到最佳表達水平。
3. 當細胞達到一定密度時,收獲細胞,通常通過離心將細胞分離出來。
二、細胞破碎和固態物去除:
1. 使用適當的破碎方法(如超聲波、高壓等)破碎收獲的細胞,釋放細胞內的單克隆抗體。
2. 除去細胞碎片和固態物質,如細胞壁殘留、脂質、核酸等,可通過離心和過濾等步驟實現。
三、親和層析:
1. 準備含特異性配體的親和層析柱,配體可以是與單克隆抗體特異結合的蛋白、蛋白G/A等。
2. 將破碎后的細胞上清液通過親和柱,使單克隆抗體與配體結合。
3. 通過洗脫步驟,使用適當的洗脫劑(如低pH、高鹽、可競爭性配體等)將單克隆抗體從柱上洗脫。
四、離子交換層析:
1. 將洗脫的樣品加載到離子交換層析柱上,根據單克隆抗體的等電點和親和性進行分離。
2. 使用不同梯度的鹽濃度或pH值,逐漸洗脫不同的蛋白質成分,將單克隆抗體分離純化。
五、尺寸排阻層析:
1. 將經過離子交換層析的樣品加載到尺寸排阻層析柱上。
2. 根據分子大小,通過柱上的多孔素材選擇性地分離和洗脫目標單克隆抗體。
六、濃縮和 Buffer 調整:
1. 使用適當的濃縮方法(如超濾、沉淀等)濃縮純化后的單克隆抗體樣品。
2. 調整樣品的緩沖液,以適應后續的儲存、分析或制劑的要求。
七、純化檢測和分析:
1. 對純化后的單克隆抗體樣品進行質量分析,如SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot等。
2. 測定單克隆抗體的濃度和純度,可以使用光譜法(如280 nm吸光度法)和蛋白質定量方法(如Bradford法)進行。
這些步驟可以根據需要進行優化和調整,具體的純化工藝流程可能會因目標單克隆抗體的特性和實驗室的實際情況而有所不同。
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